迈尔斯·莫拉莱斯（沙梅克·摩尔 配）的生活因为一次意外变得复杂。他被一只放射性蜘蛛咬伤，并因此获得了毒液冲击、伪装隐藏、蜘蛛爬行、超凡听力、蜘蛛感应等一系列超能力。与此同时，这座城市里最臭名昭著的犯罪头目金并（列维·施瑞博尔 配）已经建立起一台高度隐秘的超级对撞机，这台对撞机开启了通往其他宇宙的时空通道，来自其他宇宙、不同版本的蜘蛛侠也来到了迈尔斯所在的世界。迈尔斯和从其它平行宇宙中穿越而来的蜘蛛侠彼得·帕克（杰克·M·约翰森 配）、女蜘蛛侠格温·史黛西（海莉·斯坦菲尔德 配）、暗影蜘蛛侠（尼古拉斯·凯奇 配）、日系少女蜘蛛侠潘妮·帕克（贵美子·格伦 配）和蜘猪侠（约翰·木兰尼 配）六位蜘蛛侠首次集结成团，共同对抗蜘蛛侠宇宙最强反派。

事实上在《蜘蛛侠》漫画诞生之初就有很多不同版本的蜘蛛侠，漫威一直在该系列中尝试多元宇宙的概念，直到2014年，漫画《超凡蜘蛛侠》作者丹·斯洛特才提出将这些不同宇宙间的蜘蛛侠整合在一起，共享同一个多元宇宙，这样一来所有不同的蜘蛛侠都可以联合起来并肩作战，于是有了这部“蜘蛛侠宇宙”电影。值得一提的是，同样的概念也被运作在蜘蛛侠的死对头毒液身上，组成“毒液宇宙”。

相比真人版的电影，这部动画电影更符合“蜘蛛侠”的漫画原著风格：不仅人物对话时头顶上会冒出对话框，不少情节切换也是典型的漫画格形式，整个观影过程都有一种一边看电影一边翻漫画书的感觉。此外，该片首次起用黑人演员担任蜘蛛侠的扮演者，因此全片有着浓郁的嘻哈元素，不论是涂鸦作品还是大量的说唱配乐，都跟之前的电影作品有着明显的区别。更为值得一提的是，该片充满活力的视觉风格着实让人眼前一亮：大胆的用色和夸张的构图，瞬间抓住了观众的眼球，尤其是后期的大量打斗镜头，仿佛把主要人物丢进了万花筒里，视觉冲击感非常强烈。